友名生物(多图)-内切酶

限制性核酸内切酶是可以识别并附着特定的核苷酸序列,并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的*二酯键进行切割的一类酶,简称限制酶。根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式,可将限制酶分为三种类型,分别是型(type i)、第二型(type ii)及第三型(type iii)。ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主dna的化,又催化非化的dna的水解;而ⅱ型限制性内切酶只催化非化的dna的水解。ⅲ型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。
核酸酶污染的过夜鉴定
所有的限制性内切酶与1μg 底物dna在50μl反应体系中,采用推荐的nebuffer温育过夜。比较酶切1小时的特征带型和过夜酶切的带型。如果两种情况下带型均明显、没有改变,则说明测试的酶中不存在非特异性的dna酶。可以温育过夜的*大酶单位数。
核酸外切酶污染鉴定
所有的限制性内切酶与1μg 单双链混合的、3h标记的e.coli dna在50μl反应体系中,采用随酶提供的nebuffer,在推荐的温度下温育4小时。通过可溶解的tca着色,可以计算出反应体系中被标记的dan的百分比,内切酶,进而可以显示出核酸外切酶的污染。该种方法可检测出的底线是0.05%。
酶切图谱
图谱介绍:dna限制性内切酶酶切图谱,又称dna的物理图谱,它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成,以直线或环状图式表示。在dna序列分析、*组的功能图谱绘制、dna的无性繁殖、*文库的构建等工作中,建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节,近年来发展起来的rflp(限制性的片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。
构建方法:构建dna限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶,通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性的片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和准确程度。
制作过程:在酶切图谱制作过程中,为了获得条带清晰的电泳图谱,一般dna用量约为0.5-1μg。限制性内切酶的酶解反应*适条件各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和*适反应温度(大多数为37℃)。对质粒dna酶切反应而言,限制性内切酶用量可按标准体系1μg dna加1单位酶,消化1-2小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加2-3倍,甚至更多,反应时间也要适当延长。
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