Rab3 antibody-武汉纽斯特公司(在线咨询)
体外用gtpγs/gdp处理蛋白以用作阳性和阴性的对照
注意：在细胞体内环境条件下大约有10%的cd*2被激l活，而在体外用gtpγs处理大约有90%的cd*2被激l活。
1. 准备两个离心管，每个管中各加入0.5 ml的细胞提取物（如果是纯的cd*2蛋白则每个管中加入的蛋白量为1ug）。
2. 每个管中加入20ul 0.5m edta(终浓度即为20 mm)。
3. 一个管中加入5ul的100x gtpγs（终浓度即为100 um）作为阳性对照。另一个管中加入5ul的100x gdp（终浓度即为1 mm）作为阴性对照。
4. 将离心管置于30°c条件下反应30min并不断搅动。
5. 终止反应：将管置于冰上并加入32.5ul 1m mgcl2(终浓度即为60mm)。
*制备
1x assay/lysis buffer：实验前用去离子水将5x的assay/lysis缓冲液稀释成1x的缓冲液，并在使用前加入蛋白酶*l剂如1 mm pmsf， 10 μg/ml leupeptin（亮肽素），或 10 μg/ml aprotinin（抑肽酶）。
样品处理
贴壁细胞
1. 培养细胞密度达到大约80%-90%之间（直径10 cm培养皿，~107个细胞），并用活性剂或*l剂进行处理。
2. 吸去培养基并用冰冷的pbs洗涤两次。
3. 向细胞中加入1x assay/lysis缓冲液（每个直径10cm的组织培养皿中加入0.5-1ml）。
4. 将培养皿放置于冰上处理10-20分钟。
5. 用细胞刮棒把细胞从培养皿下分离下来。
6. 将细胞裂解物转入合适的管中并放置于冰上。
7. 如果核发生裂解，细胞裂解物可能会变得非常的粘稠并且难以吸取。当这种情况出现时，将细胞裂解物用27?的注射l器针头来回吸取3-4次，以**组dna，rab3 antibody，从而避免上述情况的出现。
8. 4°c 12000 g， 离心10 min。
9. 收集上清（~1-2 mg总蛋白）并放置于冰上使用。如果样品不立即使用，请将处理后的样品存放于-70°c条件下。
检测步骤
ι。活性cd*2 pull-down实验
1. 等分0.5-1 ml的细胞裂解物至微量离心管中。
2. 向管中加入1ml的1x assay/lysis 缓冲液。
3. 向管中加入1ul的活性cd*2单克l隆*l体。
4. 用涡旋振荡仪将protein a/g凝胶柱充分混匀，然后快速的吸出20ul悬浮珠浆液加入离心管中。
5. 将管置于4°c条件下孵育1h，并轻轻的进行摇动。
6. 5000g，离心1分钟。
7. 弃上清，这一步要非常小心以避免珠子的损失。
8. 用0.5 ml的1x assay/lysis缓冲液洗涤珠子三次，离心并弃去上清。
9. 后一次洗涤后，小心的移去所有的上清。
10. 用20ul的2x sds-page样品缓冲液重悬样品。
11. 样品煮沸5min。
12. 5000g，离心10s。
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1. 准备两个离心管，每个管中各加入0.5 ml的细胞提取物（如果是纯的cd*2蛋白则每个管中加入的蛋白量为1ug）。
2. 每个管中加入20ul 0.5m edta(终浓度即为20 mm)。
3. 一个管中加入5ul的100x gtpγs（终浓度即为100 um）作为阳性对照。另一个管中加入5ul的100x gdp（终浓度即为1 mm）作为阴性对照。
4. 将离心管置于30°c条件下反应30min并不断搅动。
5. 终止反应：将管置于冰上并加入32.5ul 1m mgcl2(终浓度即为60mm)。
*制备
1x assay/lysis buffer：实验前用去离子水将5x的assay/lysis缓冲液稀释成1x的缓冲液，并在使用前加入蛋白酶*l剂如1 mm pmsf， 10 μg/ml leupeptin（亮肽素），或 10 μg/ml aprotinin（抑肽酶）。
样品处理
贴壁细胞
1. 培养细胞密度达到大约80%-90%之间（直径10 cm培养皿，~107个细胞），并用活性剂或*l剂进行处理。
2. 吸去培养基并用冰冷的pbs洗涤两次。
3. 向细胞中加入1x assay/lysis缓冲液（每个直径10cm的组织培养皿中加入0.5-1ml）。
4. 将培养皿放置于冰上处理10-20分钟。
5. 用细胞刮棒把细胞从培养皿下分离下来。
6. 将细胞裂解物转入合适的管中并放置于冰上。
7. 如果核发生裂解，细胞裂解物可能会变得非常的粘稠并且难以吸取。当这种情况出现时，将细胞裂解物用27?的注射l器针头来回吸取3-4次，以**组dna，rab3 antibody，从而避免上述情况的出现。
8. 4°c 12000 g， 离心10 min。
9. 收集上清（~1-2 mg总蛋白）并放置于冰上使用。如果样品不立即使用，请将处理后的样品存放于-70°c条件下。
检测步骤
ι。活性cd*2 pull-down实验
1. 等分0.5-1 ml的细胞裂解物至微量离心管中。
2. 向管中加入1ml的1x assay/lysis 缓冲液。
3. 向管中加入1ul的活性cd*2单克l隆*l体。
4. 用涡旋振荡仪将protein a/g凝胶柱充分混匀，然后快速的吸出20ul悬浮珠浆液加入离心管中。
5. 将管置于4°c条件下孵育1h，并轻轻的进行摇动。
6. 5000g，离心1分钟。
7. 弃上清，这一步要非常小心以避免珠子的损失。
8. 用0.5 ml的1x assay/lysis缓冲液洗涤珠子三次，离心并弃去上清。
9. 后一次洗涤后，小心的移去所有的上清。
10. 用20ul的2x sds-page样品缓冲液重悬样品。
11. 样品煮沸5min。
12. 5000g，离心10s。
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