细胞生物学实验-细胞-南京英瀚斯
大鼠脂肪的分离
将手术切取的大鼠脂肪组织尽量剪碎后移至离心管，其余步骤与人脂肪的分离一致。
经手术切除获得的大鼠皮下脂肪组织消化后原代培养24 h，且肉眼观察会发现培养瓶底部贴附着一层网状薄膜，轻轻摇晃培养瓶可使这层网状薄膜从瓶壁上脱落，镜下观 察发现大部分细胞都附着于这层膜上，通过术获取的人脂肪组织消化后则无此现象。增加胶原酶的量和消化时间也无法避免，取材时的或脂肪间结缔组织未被完全消化，穿过细胞筛进入了培养瓶并沉淀于瓶底部形成的。胶原蛋白酶虽然可以特异性水解胶原蛋白的三维螺旋结构，但不会损伤其他蛋白质。处理方法是37 ℃下用胰蛋白酶 消化5 min。然后利用40 μm的细胞筛过滤后传代。 根据作者的经验，每毫升手术切除的大鼠脂肪可分离基质血管成分细胞约1.81×106个。原代培养2.24×10^7个大鼠基质血管成分细胞，40 h后传代时约剩余 6.2×10^6个细胞，细胞剩余率27%。
细胞传代培养
操作步骤
1.将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。
2、加入0.5- -1ml 0.25%胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。
3、瓶口塞好橡皮塞，细胞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未*起时将胰酶弃去，加入10m培养液终止消化。观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细zhen孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1- -3分钟。
4、用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37°c下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。
附:消化液配制方法:
称取0.25克胰酶蛋白酶(活力为1 : 250)， 加入100ml无ca2 、mg2 的hanks液溶解，流式细胞实验，滤器过滤chu菌，4°c保存，用前可在379c下回温。胰酶溶液中也可加入edta，使*终浓度达0.02%。
细胞elispot检测
1．培养板的预处理：在24孔培养板内加0.5ml 0.2%戊er醛，37℃，4h，弃掉板中的处理液，用pbs洗涤3次，每次3min；
2．*原包被：将适量*原溶于包被缓冲液中，每孔加入0.5ml，4℃过夜，pbs-t洗涤3次，每次3min；
3．制备细胞悬液：将待测已致敏小鼠处死，取出pi脏，置于加有hanks液的平皿内，用钝头直角9号zhu射器针头*少许脾被膜后，赶出细胞，用毛细吸管轻轻吹散细胞团后，将悬液通过250目尼龙网，取滤液，1000r/min离心5min，hanks液洗涤3次，计数细胞后，用1640液重新悬浮细胞，配成所需浓度；
4．往各孔中加入0.5ml含不同浓度（104-106/ml）的细胞悬液，置37℃，5％co2条件下孵育2-4h，弃掉培养液，pbs-t洗涤3次，动物细胞培养，每次3min；
5．往各孔中加入0.5ml生物素化*ti（bio-ab）（2μg/ml），37℃孵育1h或4℃过夜，弃掉液体，pbs-t洗涤3次，每次3min；
6．加入辣根过氧化物酶结合的亲合素（avi-hrp）（2μg/ml），37℃孵育30min，弃掉液体，pbs-t洗涤3次，每次3min；
7．配制明胶-底物液：在37℃水浴中，将2.5mltmb溶液（4mg/ml jia醇溶液）滴加入7.5ml10%明胶溶液（用ph5.0*钠-柠檬酸缓冲液配制）边加边搅，溶液呈白色，加入14μl 3% h202；
8．显色与计数：将培养板底冰浴，每孔加入0.6ml明胶-底物液，约3min，混合液凝固，将培养板取出，细胞生物学实验，置室温5min，将板倒置，用肉眼和低倍放大镜计数所显示出的颜色的斑点。
细胞生物学实验-细胞-南京英瀚斯由南京英瀚斯生物科技有限公司提供。南京英瀚斯生物科技有限公司坚持“以人为本”的企业理念，拥有一支高素质的员工队伍，力求提供更好的产品和服务回馈社会，并欢迎广大新老客户光临惠顾，真诚合作、共创美好未来。英瀚斯——您可信赖的朋友，公司地址：江苏省南京市栖霞区和燕路371号东南大学国家大学科技园科创楼a301，联系人：戴经理。
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1.将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。
2、加入0.5- -1ml 0.25%胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。
3、瓶口塞好橡皮塞，细胞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未*起时将胰酶弃去，加入10m培养液终止消化。观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细zhen孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1- -3分钟。
4、用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37°c下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。
附:消化液配制方法:
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1．培养板的预处理：在24孔培养板内加0.5ml 0.2%戊er醛，37℃，4h，弃掉板中的处理液，用pbs洗涤3次，每次3min；
2．*原包被：将适量*原溶于包被缓冲液中，每孔加入0.5ml，4℃过夜，pbs-t洗涤3次，每次3min；
3．制备细胞悬液：将待测已致敏小鼠处死，取出pi脏，置于加有hanks液的平皿内，用钝头直角9号zhu射器针头*少许脾被膜后，赶出细胞，用毛细吸管轻轻吹散细胞团后，将悬液通过250目尼龙网，取滤液，1000r/min离心5min，hanks液洗涤3次，计数细胞后，用1640液重新悬浮细胞，配成所需浓度；
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7．配制明胶-底物液：在37℃水浴中，将2.5mltmb溶液（4mg/ml jia醇溶液）滴加入7.5ml10%明胶溶液（用ph5.0*钠-柠檬酸缓冲液配制）边加边搅，溶液呈白色，加入14μl 3% h202；
8．显色与计数：将培养板底冰浴，每孔加入0.6ml明胶-底物液，约3min，混合液凝固，将培养板取出，细胞生物学实验，置室温5min，将板倒置，用肉眼和低倍放大镜计数所显示出的颜色的斑点。
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